ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ"

Возникновение и развитие бруцеллезного процесса, формирование его патогенетических фаз сопровождается иммунологической перестройкой организма. Феномены иммунологической перестройки при бруцеллезе послужили основанием для создания различных методов диагностики. Значение своевременной диагностики и сложность ее при бруцеллезе уже давно осознаны.

Наименее достоверным является клинический метод диагностики, т.к. клинические признаки болезни дают основание лишь подозревать у животных наличие бруцеллеза, ибо аналогичные симптомы заболевания могут появляться и при ряде других причин инфекционного и неинфекционного характера.

Наиболее точным методом диагностики является бактериологический- выделение культуры бруцелл от больного животного или из абортированного плода. Однако и в этом случае о точности можно говорить лишь при нахождении возбудителя; отрицательный же результат исследования еще не является убедительным доказательством отсутствии бруцеллеза. Кроме того, этим методом трудно провести массовую проверку скота.

Порядок исследования патологического материала:

1.Учет эпизоотологических данных (что не всегда удается).

2.Вскрытие плода для бактериологического исследования.

3.Посевы на питательные среды с последующим выделением чистой культуры. Часть посевов выращивают в атмосфере углекислого газа.

4.Микроскопия мазков, окрашенных по Грамму или Козловскому.

5.Биопроба. Заражение лабораторных животных, чаще морских свинок.

6.Микроскопия мазков из выделенных культур.

7.РА на стекле с выделенными культурами.

Работами многих исследователей подтверждена высокая специфичность и чувствительность аллергического метода диагностики бруцеллезной инфекции. Но есть недостаток. Аллергическая реакция появляется в более поздние периоды развития инфекции, а в борьбе с бруцеллезом имеет большое значение ранняя диагностика заболевания. Чем раньше будут выделены больные животные и, следовательно, чем раньше будут приняты соответствующие меры борьбы, тем большая гарантия быстро ликвидировать очаг инфекции.

Этому требованию более удовлетворительно отвечают серологические способы исследования в сравнении с методами бактериологической и аллергической диагностики.

Из серологических способов диагностики бруцеллеза наиболее широко применяется реакция агглютинации,предложенная в 1897 г. Райтом и Семплом. Под названием реакции Райта она вошла в широкую практику вследствие простоты постановки, легкости учета и большой диагностической ценности.

РА основана на специфическом взаимодействии сыворотки больного бруцеллезом животного с бруцеллезным антигеном. Эта реакция зависит от наличия в сыворотках крови специфических антител.

Сущность РА заключается в том, что при добавлении к исследуемой сыворотке антигена (взвеси гомологичных микробов) постепенно происходит скучивание микробов с образованием комочков, оседающих на дно пробирки в виде зонтика. Процесс агглютинации протекает в 2 фазы: в первой фазе микробы соединяются с агглютининами (специфическая фаза). Во 2-й фазе происходит скучивание микробов и выпадение их в осадок под влиянием электролитов, нарушающих равновесие этой взвеси (неспецифическая фаза). Этот осадок называется агглютинатом.

Пластинчатая реакция агглютинации с роз-бенгал антигеном (РБП).Антиген для РБП представляет собой суспензию бруцелл, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет. При соединении бруцелл с антителами образуются комочки красного цвета. Ставится реакция на эмалированных белых пластинках с луночками.

Кольцевая проба с молоком. В молоке также имеются агглютинины. К 2 мл. молока добавляют 1-2 капли антигена, окрашенного гемотоксилином в синий цвет. При наличии в молоке бруцеллезных антител окрашенный антиген соединяется с ними и с капельками жира. На поверхности молока образуется кольцо синего цвета, а толща молока белая. При отрицательной реакции молоко остается равномерно окрашенным.

Для диагностики бруцеллеза в практике широко применяется также реакция связывания комплемента (РСК).

Сущность РСК состоит в том, что при соединении антигена со специфическим антителом образуется комплексное вещество (антитело + антиген), обладающее способностью адсорбировать (связывать) на своей поверхности комплемент. РСК протекает в 2 фазы. Вначале соединяют испытуемую сыворотку с антигеном и вводят в эту систему оттитрованное количество комплемента (бактериолитическая система). Если взяты специфические компоненты, например, бруцеллезная сыворотка и бруцеллезный антиген, то произойдет их соединение и адсорбция комплемента. Следовательно, в системе не останется свободного комплемента, т.к. он целиком будет адсорбирован комплексом антиген + антитело. Если в сыворотке крови не имелось специфических антител, комплемент остается в системе в свободном состоянии. Это первая фаза реакции.

Чтобы узнать произошла ли адсорбция комплемента в первой фазе или он остался свободным, вводят в реакцию вторую, так называемую гемолитическую систему, всегда специфическую, состоящую из эритроцитов барана (антиген) и специфической гемолитической сыворотки (антитело). Это вторая фаза.

Гемолитическая сыворотка обладает способностью разрушать, лизировать эритроциты барана в присутствии свободного комплемента. Поэтому вторая фаза является индикатором процессов, происходящих в первой фазе реакции.

Если в первой фазе реакции были соединены неспецифические компоненты и не наступило адсорбции комплемента, то свободный комплемент присоединится к гемолитической системе, произойдет лизис эритроцитов. Это будет указывать на отрицательный результат реакции в первой фазе.

Наоборот, если в первой фазе будут взяты специфические компоненты, то произойдет их соединение и одновременно адсорбция комплемента. Тогда, в силу отсутствия свободного комплемента во второй фазе реакции, лизис эритроцитов не наступит. Реакция положительная.

С 2006 г. для диагностики бруцеллеза утверждена реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Сущность. На эритроциты адсорбируется бруцеллезный антиген и этот эритроцитарный диагностикум добавляется к разведениям сыворотки. Если в сыворотке крови есть бруцеллезные антитела, то происходит агглютинация, выпадает осадок в виде зонтика. Если реакция отрицательная, то эритроциты осядут на дно в виде пуговки.

С 80-х годов 20-го столетия в стране появилось много работ, посвященных, разработке иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики бруцеллеза. Принцип метода. Как и все иммунологические методы ИФА базируется на реакции взаимодействия антитела с антигеном. ИФА основан на выявлении комплекса антиген-антитело, образуемого адсорбированным на поверхности лунок полистироловых планшетов для иммунологических реакций антигеном с находящимся в испытуемом материале (сыворотках) специфическими антителами. Образованный комплекс вступает в реакцию с меченым пероксидазой иммуноглобулином антивидовой гипериммунной сыворотки.

Образовавшийся специфический комплекс выявляют посредствам добавления субстратной смеси, включающей в себя субстрат пероксидазы – перекись водорода и вещество, которое окисляясь, дает окрашенный продукт. Величина оптической плотности продукта ферментативной реакции пропорциональна содержанию антител в испытуемом материале.

Регистрацию и учет реакции проводят визуально или спектрофотометрически.

В 2003 году в ветеринарную практику был принят метод молекулярно-генетической диагностики бруцеллеза – полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР предназначена для выявления ДНК бактерий рода Brucella (B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. ovis, B. canis) в биологическом материале от животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, в случае аборта или проявления у них других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты), вызывающих подозрение на бруцеллез и (или) при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования.

ПЦР-анализ состоит из 3-х этапов: 1. Выделение ДНК из исследуемого материала. 2. Собственно ПЦР – амплификация специфического участка ДНК бруцелл. 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР и учет результатов ПЦР-анализа.

Диагностика бруцеллеза осложняется еще тем, что от животных, отрицательно реагирующих со стандартными антигенами из типичных S-форм бруцелл, выделяются атипичные диссоциированные штаммы в R-форме. В этих случаях для успешной ликвидации бруцеллеза необходимо применять такой антиген, который разработан, апробирован и внедрен бруцеллезный R-антиген ВНИВИ, который улавливает только R-антитела. Применяется для дифференциальной диагностики бруцеллеза в стадах, где животных прививают вакциной из штамма 82.

Бруцеллёз–это зоонозная инфекция, передаваемая от животных человеку посредством контакта с заражёнными животными или при употреблении инфицированного мяса, молока и молочных продуктов. Возбудителями инфекции являются мелкие грамотрицательные бактерии – бруцеллы, относящиеся ко II группе патогенных для человека микроорганизмы и названы по имени своего первооткрывателя – Дэвида Брюса.

Бруцеллез отмечается на всех континентах в большинстве стран мира. Особенно в странах Средиземноморья, Восточной Европы, Южной и Центральной Америки, Африки, Центральной и Южной Азии, Кавказа, Аравийского полуострова, Ближнего Востока. В этих регионах бруцеллёз встречается в основному крупного рогатого скота (КРС), мелкого рогатого скота (МРС), а также у диких свиней, бизонов, лосей, зайцев. По самым скромным подсчётам более 300 миллионов из 1,4 миллиарда поголовья КРС в мире заражены возбудителем бруцеллёза. Хроническое, чаще бессимптомное и длительное течение бруцеллёзной инфекции у животных делает её трудно диагностируемой. Устойчивость к факторам внешней среды и исключительная пластичность возбудителя, при наличии достаточного относительного постинфекционного иммунитета, определяют всю сложность борьбы с инфекцией.

Ареал распространения бруцелл разных видов в основном связан с ареалом основного хозяина. В тоже время приуроченность определенных видов (или штаммов) бруцелл к конкретным территориям часто связана с хозяйственной деятельностью человека. Паразитарная система бруцеллеза представляет собой сложную систему взаимодействия, включающую как самого паразита (несколько видов бруцелл), так и многочисленный ряд видов хозяев, как основных, так и факультативных. Данная система включает в себя две экологические ниши паразита. Существование одной поддерживают сельскохозяйственные животные, другой– дикие виды. Частые контакты этих групп животных на территориях выпаса, создают угрозу расширения инфекционных очагов.

При заражении инкубационный период длится 2-4 недели. Если среди восприимчивого поголовья нет беременных животных, заболевание, как правило, протекает бессимптомно. Диагностировать заболевание можно лишь при проведении серологического и аллергического методов исследования. Заболевание сопровождается абортами в разный период беременности в зависимости от вида животного, истечениями из половых органов, задержанием последа, эндометритами, маститами. Поднимается температура, наблюдается снижение массы тела. Поражение органов репродукции влечёт за собой нарушение воспроизводительной функции, а порой и бесплодие. Наблюдаются также бурситы, артриты, тендовагиниты, орхиты и эпидимиты.

Основными причинами возникновения и распространения бруцеллезной инфекции среди сельскохозяйственных животных являются:

-несогласованное с органами государственного ветеринарного надзора приобретение и ввоз животных из других регионов без проведения карантинных мероприятий;

-несогласованное с органами государственного ветеринарного надзора приобретение и ввоз кормов из регионов неблагополучных по бруцеллёзу;

-отсутствие должного контроля со стороны органов исполнительной власти за перемещением и регистрацией поголовья скота;

-совместное содержание животных различных видов (КРС, МРС) в личных подсобных хозяйствах;

-несвоевременная сдача больных животных на убой;

-совместный выпас животных различных видов и использование общих мест водопоя животными из благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйств.

Распространению бруцеллезной инфекции среди животных способствует также наличие скрытых бруцеллоносителей среди МРС, выявить которых с помощью существующих диагностических методов затруднительно из-за длительно сохраняющихся поствакцинальных реакций, не подлежащих надежной дифференциации.

Профилактика бруцеллёза основана на выполнении основных ветеринарно-санитарных правил по охране благополучных хозяйств от заноса возбудителя инфекции. Необходимо исключить возможности контакта здорового поголовья с больным, а также различных групп скота на пастбищах, местах массового скопления животных и при перевозке. Необходимо проводить плановые профилактические диагностические исследования и вакцинации.

Наибольшее распространение для иммунизации животных против бруцеллеза получили живые аттенуированные вакцины. Помимо цельноклеточных вакцин против бруцеллёза разрабатываются препараты на основе антигенов, выделенных из бруцелл, рекомбинантные и ДНК-вакцины. За рубежом широко применяют американскую живую вакцину из неагглютиногенного штамма В. abortus RB-51, имеющего стабильные биологические и иммуногенные свойства.

В последние годы в нашей стране мелкий рогатый скот иммунизируют в основном живой вакциной из штамма B. melitensisRev-1, значительно меньше – вакциной из штамма B. abortus 19, а крупный – вакциной из штамма 82 B. abortus,реже – из штаммов B. abortus 75/79-АВ.

При решении актуальных задач в плане совершенствования специфической профилактики бруцеллёза животных, применяются новые препараты, зарегистрированные в РФ в 2013г. А именно, «Антиген из штамма BrucellaabortusR-1096 для выявления латентных форм бруцеллёза у крупного рогатого скота» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ). Он предназначен для провокации S-бруцеллёзных антител у инфицированных животных с латентной или скрытой формой болезни, сенсибилизации неиммунизированного скота против бруцеллёза крупного рогатого скота перед иммунизацией вакциной из штамма B. abortus с целью профилактики, вызываемых ею абортов и поддержания перманентного иммунитета без поствакцинальной серопозитивности.

Также для выявления скрытых форм бруцеллёза у крупного рогатого скота применялся «Антиген БИВ для выявления скрытых форм бруцеллёза у крупного рогатого скота (ФГУП «Щёлковский биокомбинат»).

Возобновляется производство и внедрение в практику инактивированной адъювант-вакцины из штамма B.abortusKB17/100 против бруцеллёза крупного рогатого скота или аналогичной вакцины.

Анализ тактики проведения профилактической вакцинации животных и людей с 2003 по 2009 годы позволяет разделить субъекты Российской Федерации на пять групп. Первую группу составили семь регионов РФ, в которых иммунизировали против бруцеллеза мелкий и крупный рогатый скот; вторую – 13 субъектов, где иммунизировали только крупный рогатый скот; третью – семь субъектов – прививали крупный и мелкий рогатый скот, а также контингент риска по этой инфекции; четвертую – девять субъектов–прививали крупный рогатый скот и население; пятую – также девять субъектов – прививали только население.

В первой группе иммунизировано против бруцеллеза 21% мелкого и 32% крупного рогатого скота, принадлежащего хозяйствам сельхозпредприятий. Иммунопрофилактика обоих видов животных проводилась независимо от наличия больного поголовья мелкого рогатого скота. В Саратовской области формирование очагов овечьего бруцеллеза было связано с несанкционированным ввозом животных. Заболеваемость бруцеллезом людей составила 24,2% от общего количества больных, учтенных в стране в анализируемый период. Анализ показал некоторое снижение регистрации свежих случаев бруцеллеза (в 1,2 раза). Однако в ряде субъектов Южного Федерального округа РФ число новых случаев бруцеллеза оставалось на прежнем уровне. Следовательно, проведение иммунопрофилактики мелкого и крупного рогатого скота в хозяйствах только одной формы собственности(животные сельхозпредприятий) лишь сдерживало дальнейший рост заболеваемости людей, но существенно не влияло на нее.

Во второй группе субъектов осуществлялась вакцинация только крупного рогатого скота сельхозпредприятий. Охват прививками поголовья составил 11,1% от всего количества привитого крупного рогатого скота. Заболеваемость бруцеллезом людей в этой группе субъектов была низкой(3,6%) и в ходе проведения исследования в целом не изменялась. Лишь в трех субъектах (Томская, Самарская области и Еврейская автономная область) регистрация новых случаев бруцеллеза возросла с 13 до 24% в связи с ухудшением эпизоотической ситуации по заболеваемости мелкого рогатого скота из-за несанкционированного ввоза больных овец.

В третьей группе насчитывалось больше всего вакцинированных овец (79%) и крупного рогатого скота (42%), преимущественно в Южном Федеральном округе (соответственно 67,4% и 23,3%), – в отличие от первой группы, здесь проводилась вакцинация овце поголовья частных хозяйств (в пяти субъектах из семи). При этом шесть субъектов были неблагополучными по бруцеллезу мелкого рогатого скота. В этой группе выполнен наибольший объем специфической иммунизации населения из групп риска – 61% –вакцинация, 62,6% – ревакцинация (в Южном и Сибирском Федеральных округах РФ – 20,2% и 45,6% и 31% и 13,5% соответственно). В данной группе была наибольшая заболеваемость бруцеллезом людей (57,6%). При проведении дальнейших исследований регистрация новых случаев бруцеллеза снизилась в 1,5 раза. Лучший эпидемиологический эффект, по сравнению с первой группой, объясняется охватом профилактической иммунизацией не только поголовья сельхозпредприятий, но и частных хозяйств (пять субъектов из семи), а также населения, входящего в группу риска по этой инфекции.

В субъектах четвертой группы насчитывалось 14,4% привитого против бруцеллеза крупного рогатого скота, принадлежащего сельхозпредприятиям. В этой группе официально регистрировался не только больной крупный рогатый скот, но и мелкий, который не прививался. В одних субъектах очаги мелкого рогатого скота были завозного характера, в других–они регистрировались систематически. В ходе проводимых исследований регистрация новых случаев заболевания возросла в 1,6 раза. При этом в четырех субъектах заболеваемость возросла в 4,6 раза, в основном за счёт Алтайского края, где эпидемическая вспышка была вызвана несанкционированным ввозом больных овец и коз из Казахстана (2008 г.).

В пятой группе субъектов очаги бруцеллеза мелкого рогатого скота в частных хозяйствах были вызваны несанкционированным ввозом больных овец в Калужскую, Владимирскую и Свердловскую области. Больше всего прививали население Ханты-Мансийского АО, Республики Татарстан и Вологодской области. Показанием к вакцинации стала ежегодная регистрация новых случаев бруцеллеза у людей, при отсутствии официальных сведений об эпизоотическом неблагополучии по бруцеллезу, что говорит о наличии не выявленных источников инфекции на указанных территориях. В целом заболеваемость бруцеллезом людей в этой группе была низкой – 1,2%, и в динамике исследования она возросла в 1,2 раза.

Анализ проведенных профилактических мероприятий среди животных и людей в 2003 – 2009 годах показал, что специфической вакцинацией были охвачены территории субъектов Российской Федерации, на которых зарегистрирована наибольшая заболеваемость людей(82,4%). Вместе с тем регистрацию новых случаев бруцеллеза удалось снизить в 1,5 раза только на тех, где прививками были охвачены оба вида сельскохозяйственных животных всех форм собственности (включившие 85,3% вакцинированного поголовья овец и 57,9% – крупного рогатого скота от всех привитых животных третьей группы) и контингент риска инфицирования.

Зоонозные инфекции, приобретающие в последние годы большое значение для здоровья населения, требуют комплексности проводимых межведомственных мероприятий со стороны государственных ветеринарной и санитарно-эпидемиологической служб, с целью установления причин заболевания, факторов передачи и широты восприимчивых контингентов. Только тесное, объективное взаимодействие указанных служб на всех уровнях надзора создаст надёжную систему защиты инфицирования и заболевания животных (источник и резервуар зоонозных инфекций), а это в свою очередь позволит в дальнейшем минимизировать риск развития инфекции у человека.

Список используемой литературы:

1.Горчакова,Н.Г.Особенности паразитарной системы бруцеллёза/ Научно-исследовательские публикации. 2017.-№4.-С.14-27.

2.Информационный ресурс сайт Россельхознадзора /Обзор эпидемиологической и эпизоотологической ситуации по бруцеллезу в мире в 2018 году и прогноз на 2019 год в Российской Федерации/ Публикация от 20.02.2019

http://www.rsnso.ru/documents/publications/?n=2367&tag=%D0%B1%D1%80%D1%83%D1%86%D0%B5%D0%BB%D0%BB%D0%B5%D0%B7

3.Конопаткин,А.А.Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных. / Бакулов И.А., НуйкинЯ.В. и др. //Учебники и учебные пособия для высших сельскохозяйственных учебных заведений.- М.: Колос.-1984. – 544с.

4.Литусов, Н.В. Возбудители бруцеллеза. Иллюстрированное учебное пособие.– Екатеринбург: Изд-во УГМА, 2012. - 38 с.

5.Скляров, О.Д. Бруцеллёз /Презентация/ ФГУ «Всероссийский государственный бюджетный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»)- 25 слайдов.

6.Цирельсон,Л.Е. Состояние специфической иммунопрофилактики бруцеллеза в Российской Федерации. / Желудков М.М., Скляров О.Д., Боровой В.Н. //Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. №1 (56).-2011.- С.59-64.