Метагеномика - как перспективный инструмент оценки статуса здоровья почв

Биота почвы является неотъемлемой частью экосистемы почвы. Оценка статуса в моменте или мониторинг - важнейшая часть системы управления здоровьем почв.

Методы изучения микробиты почвы – от питательных сред к метагеномке

Долгое время изучение микробиоты почв ограничивалось методом культивирования на питательных средах – этот метод и сейчас является не только широко распространенным, но и постоянно развивающимся – побираются новые методы выделения и культивирования, совершенствуются системы интерпретации результатов анализа. Однако, еще в середине 1980-х годов стало понятно, что те микробные колонии, которые культивируются на чашках Петри, составляют лишь незначительную долю (0.1–5%) от общего разнообразия микроорганизмов в почве и начался поиск других более информативных методов. Одним из них стал -метагеномный анализ. Впервые термин “метагеномика” был предложен в 1998 г.с целью обозначить исследования, в которых проводится анализ коллективных геномов, полученных из образцов окружающей среды. Метагеномика - анализ совокупных геномов сообщества организмов.

Метагеномный подход стал возможен благодаря развитию высокопроизводительного секвенирования – современных технологий «прочитывания» нуклеотидной последовательности ДНК, позволяющих анализировать крупные объемы генетической информации. Наиболее популярен в метагеномных исследованиях анализ гена 16S рРНК, на строении которого основана современная филогенетическая классификация прокариотических организмов.

С помощью метагеномного анализ определяется статус микробиоты в медицине/ветеринарии. Выделение из почвы требует учет дополнительных нюансов

: 1) неоднородность почвенного покрова, неравномерное размещение микроорганизмов в почвенных агрегатах и возникающая в связи с этим проблема репрезентативности почвенных образцов; 2) адсорбция клеток на почвенных частицах, ингибирование амплификации присутствующими в почве гуминовыми веществами и проблема экстракции и очистки ДНК; 3) высокое разнообразие сообществ, их разный физиологический статус и наличие внеклеточной ДНК.

Еще одной особенностью почв является неоднородность условий внутри почвенных агрегатов. Твердые частицы и агрегаты делят почву на многочисленные частично или полностью изолированные микрозоны, в которых могут создаваться контрастные условия. В пределах агрегатов могут параллельно сосуществовать сотни и тысячи таких микрозон . Микроорганизмы заселяют эти ниши в соответствии со своими потребностями в питании и выживании, что приводит к неравномерному распределению микробиома внутри почвенных агрегатов . Дизайн методики должен учитывать неоднородность почвенного покрова и неоднородное распределение микроорганизмов на поверхности/внутри почвенных агрегатов, чтобы установить количество повторности, достаточное для получения корректных результатов.

Метагеномика – часть структурно-функциональный ряда

Для получения объективной информации предлагается использовать комплексный подход:

– Метагеномный подход потенциально определяет всю генетическую информацию микробиома, в том числе о покоящихся формах и отмерших микроорганизмах.

– Анализ биомаркеров позволяет оценивать и сравнивать состав микробиома, функционирующий на данный момент.

– Анализ ферментативной активности дает информацию об актуальной функциональности почв, но не позволяет определять таксономический состав микробиома.

Некоторые результаты метагеномных анализов

В России метагеномные исследования почв проводятся уже несколько лет . Например,

В Почвенном институте им В.В. Докучаева создана и постоянно пополняется коллекция почвенных образцов для анализа микробиома. Разработана собственная методика получения высокоочищенных ДНК из почвы, освоены методики конструирования праймеров, благодаря которым можно проводить анализ 20 почвенных образцов одновременно, с выходом 7 около 3-3,5 тыс н.п. на один образец, ПЦР-анализа почвенной микробиоты с детекцией в реальном времени и таксономическим анализом сложных сообществ микроорганизмов .

Кроме Почвенного института им. В.В. Докучаева в исследованиях принимают участие ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, коллективы учёных из Агрофизического института А.Ф. Иоффе, НИИСХ Центрально-чернозёмной полосы им В.В. Докучаева, Белгородский НИИСХ, Курский НИИ АПП и лаборатория по оценке экономической деградации почв МГУ им. М.В. Ломоносова .

Пример практического применения метагеномного анализа – изучение биоты солончаков и определение бактерий индикаторов процесса засоления. В модельном опыте по искусственному засолению наблюдалось значительное снижение уровня разнообразия микробиоты. В сообществе увеличилась доля бактерий из семейств Bacillaceae, Streptomycetaceae, Nocardioidaceae и Balneolaceae. В результате были предложены кандидаты на роль индикаторов процесса засоления – бактерии из семейств Bacillaceae и Balneolaceae.

Проведено сравнение таксономической структуры сообществ залежей и агрочернозёмов в НИИСХ Центрально-чернозёмной полосы им. В.В. Докучаева . По результатам исследования, было выделено 4 группы микроорганизмов-идентификаторов почв, процессов и условий.

Первую группу составляли семейства, доля которых уменьшается в пахотных почвах по сравнению с залежью: Conexibacteraceae, Patulibacteracaea,Hyphomicrobiaceae, Syntrophobacteraceae.

Во вторую группу входили семейства, доля которых в залежных почвах меньше, чем в пахотных: Geodermatophilaceae, Micrococcaceae, Rhodospirillaceae, Sphingomonadaceae.

В третью группу вошли семейства, доля которых снижается в почвах при внесении минеральных удобрений: Solirubrobacteraceae, Enterobaceraceae, Pseudomonadaceae, Gaiellaceae.

Четвёртая группа состояла из семейств, доля которых увеличивается привнесении минеральных удобрений - Chitinophagaceae,Bacillaceae, археи филума Crenarchaeota, семейства Nitrososphaeraceae.

Приведу и зарубежный пример. Во Франции произведена попытка картографирования пространственного распределения почвенных микробных сообществ. Для этого были отобраны и проанализированы 2173 образцов почв . В результате были построены карты видового богатства, микробного разнообразия и распространения отдельных таксонов. Благодаря таким картам авторам удалось показать роль разных почвенно-экологических факторов в формировании структуры почвенных микробиомов, среди которых наиболее значимыми оказались pH, тип землепользования и гранулометрический состав.

Делаются лишь первые шаги – но уже очевидно , метагеномика является перспективным направлением по изучению здоровья почв. Это возможность более полного исследования почвенного микробиома, в перспективе включающее изучение свойств не только культивируемых, но и некультивируемых микроорганизмов, определение состава и функций почвенных микробных ассоциаций, выяснение объема и функциональной нагрузки почвенного микробного сообщества и его генетического потенциала.

При подготовке публикации использованы материалы следующих печатных работ:

Метабаркодинг и метагеномика в почвенно-экологических исследованиях: успехи, проблемы и возможности, Семенов М.В.,2019

Метагеномный анализ прокариотных сообществ профилей почв Европейской части России, Чернов Т.И., 2016

Does fresh farmyard manure introduce surviving microbes into soil or activate soil-borne microbiota? MikhailV. Semenova,*, GeorgeS. KrasnovV.,2021

Новые методы анализа почвенного микробиома, изученной с использованием метагеномных технологий, Першина Е.В., 2013

Перспективы применения методов почвенной метагеномики для определения качества почв садовых ценозов, Агафонова В. А., Попова В.П., 2021

Методология микробиологических исследований почвы в рамках проекта “МИКРОБИОМ РОССИИ” , Т. И. Чернов, В. А. Холодов, Б. М. Когут, А. Л. Иванов. , 2017

На фотографии данного поста -представлен пример результатов метагеномного анализа почв.

Буду благодарна за комментарии – что нового вы узнали из сообщения? Как вы оцениваете статус биоты почвы ваших полей- какой метод выбираете? Если вы делаете анализ биоты – какую основную цель вы преследуете? Как интерпретируете результаты? Были ли получены результаты, которые удалось использовать в практике ,например, для оценки технологических решений.