Особенности ПЦР-диагностики артрита-энцефалита коз (АЭК)

Диагностика артрит-энцефалита коз (АЭК) достаточно сложная задача. Поэтому заболевание и считается труднодиагностируемым. 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), несмотря на свою высокую точность, не является здесь универсальным решением. Эффективность ПЦР при выявлении заболевания АЭК напрямую зависит от понимания фундаментальных особенностей самого вируса.

Вирус АЭК — лентивирус, чей генетический код записан на молекуле РНК. Это коренным образом отличает его от ДНК- вирусов. РНК — одноцепочечная и химически нестабильная молекула, которая легко разрушается ферментами при неправильном заборе или хранении пробы. Для её обнаружения требуется не обычная ПЦР, а её особая разновидность — ОТ-ПЦР (RT-PCR). В этом методе обязателен первый этап — «обратная транскрипция», когда вирусная РНК с помощью фермента превращается в более стабильную ДНК-копию, которую уже можно амплифицировать. Любая ошибка на этом этапе или деградация исходной РНК ведёт к ложноотрицательному результату.

Главная диагностическая сложность заключается не в технологии, а в биологии возбудителя. Вирус АЭК характеризуется тканевой тропностью и латентностью.

Вирус предпочитает не кровь, а конкретные органы-мишени: синовиальные оболочки суставов, молочную железу, лёгкие, центральную нервную систему. Именно там происходит его основная репликация.

В периферическую кровь вирус попадает непостоянно, короткими эпизодами и в очень малых количествах, часто ниже порога чувствительности коммерческих тест-систем.

Как и все ретровирусы, АЭК встраивает свою ДНК-копию (провирус) в геном клеток хозяина (макрофагов) и может годами находиться в «спящем» состоянии, не производя новых вирусных частиц и оставаясь невидимым для ПЦР, ищущей РНК.

Из-за вышесказанного, результат ПЦР критически зависит от того, что именно берут на анализ.

Наименее эффективный материал: цельная кровь. Отрицательный результат ПЦР крови — обычное явление для бессимптомного носителя. Он лишь говорит, что в момент взятия пробы вирусную РНК в кровотоке обнаружить не удалось.

Наиболее информативные материалы (при наличии клиники):

Синовиальная жидкость из воспаленного сустава.

Молоко (особенно при индуративном мастите).

Биоптаты пораженных тканей (например, участок вымени).

Цереброспинальная жидкость (при неврологической форме у козлят).

                                            Молоко

Желательно среднюю пробу. Первые и последние струйки не подходят. Анализ помещается в стерильную пробирку. Сразу же добавляется консервант на основе бронопола или водный раствор RNAlater®.

Охлажденный до +4С стабилизированный анализ можно хранить до двух суток. Замороженный до -20С образец молока можно хранить до месяца. 

При глубокой заморозке в жидком азотк срок хранения образца неограничен.

Пробирка должна быть устойчива к воздействию низких температур, иначе лопнет.

Заполняется пробирка не больше чем на 2/3 объема, иначе разорвет.

Сразу опускать пробирку с молоком в жидкий азот нельзя! Сначала опускаете пробирку в газовую зону сосуда дьюара на 30-60 минут. Только после этого окунаете в жидки азот.

Транспортировка или в сосуде дьюара или в термоконтейнере на сухом льду (-78С).

Образец должен быть небольшой – 3 – 5 мм (размером со спичечную головку). 

Брать образец можно только стерильным инструментом.

После взятия немедленно стабилизировать, иначе ферменты быстро разрушат РНК вируса.

Стабилизация: образец ткани помещают с среду RNAlater®в пропорции 1 к 10 – на 1 г ткани 10 мл стабилизирующего раствора. Чтобы раствор хорошо пропитал ткани его помещают в холодильник на сутки при температуре +4С. Если образец требуется быстрее доставить в лабораторию, можно пропитывать 12 часов.

Следующим этапом образец замораживают для краткосрочного хранения при температуре -20С. Для долгосрочной заморозки в жидком азоте действуют по тем же правилам, что и при заморозке молока. Перевозка в термоконтейнере на сухом льду.

Синовиальную жидкость, как правило, берут из запястного или скакательного суставов. Жидкость берется по всем правилам хирургической операции: поле выбривается, обрабатывается йодом. Жидкость берется инсулиновым шприцем под местной анестезией, после чего немедленно стабилизируется транспортной средой для вирусов, RNAlater®. Самое простое: можно перелить в пробирку с сиреневой крышкой.

Кратковременное хранение до суток при температуре +4С

Среднесрочное до 21 дня при температуре -20С

Долгосрочное при глубокой заморозке.

Транспортировка в термобоксах с хладоэлементами. Образцы глубокой заморозки транспотируют в термобоксах на сухом льду.

Геном лентивирусов отличается высокой изменчивостью. Мутации в участке, на который нацелены праймеры (затравки для ПЦР), могут привести к тому, что они не смогут связаться с вирусной РНК. Это также ведёт к ложноотрицательному результату. Для минимизации риска производители тест-систем выбирают наиболее консервативные (устойчивые к изменениям) участки генома, но гарантии на 100% нет.

ПЦР-диагностика АЭК — это высокотехнологичный, но ограниченный инструмент. Она незаменима для подтверждения активной инфекции у животных с клиническими признаками или для проверки статуса молодняка, но её отрицательный результат у клинически здоровой козы не исключает латентного носительства.

Следует помнить, что комплексная диагностика АЭК, включающая серологический скрининг (ИФА) и подтверждающие тесты (иммуноблот, ПЦР), — процесс достаточно дорогостоящий и длительный. 

АЭК представляет опасность только для мелкого рогатого скота и не передаётся людям благодаря межвидовому барьеру. Для товарных ферм нет необходимости проводить дорогостоящую диагностику всего стада.