Каннас – Кормление молочных коз. Гл. 4. Белки козьего молока

Молоко – сложная биологическая жидкость, вырабатываемая молочной железой, выполняет три основные функции: питательную, иммунологическую, физиологическую. В последнее время в исследованиях подчеркивается физиологическая роль молока, потребительский спрос на высококачественные продукты увеличился. Следовательно, индустрия переработки начала обращать особое внимание на пищевые и диетические характеристики молочного сырья. В развитых странах молочные белки составляют около 30% от общего количества белков, потребляемых с пищей, кроме того, с молоком потребители получают до 75% кальция рациона (Meisel, 1993a,b, 1997; Morand-Fehr, 1996; Reinert and Fabre, 1996; Spuergin et al., 1997; Restani et al., 1999).

Несколько медицинских исследований были посвящены влиянию потребления коровьего молока на здоровье, в том числе на развитие рака. Однако имеющиеся данные противоречивы из-за сложных взаимодействий между компонентами молока. Тем не менее, некоторые авторы отметили положительную линейную связь между раком и рационами с высоким уровнем энергии, в том числе и при потреблении молока высокой жирности (Attaie and Richter, 2000). Однако молоко содержит и липидные компоненты, являющиеся хорошо известными антиканцерогенными веществами (Parodi, 1997). По данным Всемирного фонда исследования рака, липидные компоненты молока и продуктов его переработки повышают риск развития только двух видов рака (почек и предстательной железы) (WCRF, 1997).

В одном из первых исследований использования козьего и ослиного молока высокая младенческая смертность была связана с плохими микробиологическими характеристиками используемого продукта (Michel, 1910). В результате во многих странах более полувека козье молоко не рекомендовалось для питания человека. Однако с 1980-х гг. несколько других исследований, в том числе и эпидемиологических, продемонстрировали его питательные свойства и наличие ценных в биохимическом отношении компонентов, поэтому в настоящее время исследователи считают козье молоко и его продукты благоприятными для питания (Domeniconi and Balzola, 1980; Birkbeck, 1984; Parry, 1984); Darnton Hill et al., 1987; Awiatlo et al., 1990; Park, 1991; Houdebine, 1995; MacDonald, 1995; Albertini et al., 1999).

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США пришло к выводу, что продукты от клонов КРС, свиней, коз и их потомства так же безопасны для употребления в пищу, как и продукты от животных, выращенных традиционным способом (Rudenko and Matheson, 2007). Это решение о безопасности пищевых продуктов, безусловно, будет широко обсуждаться в самом ближайшем будущем.

Характеристики молока связаны с окружающей средой и видом. Например, существует положительная линейная связь между логарифмом содержания молочного белка и массой тела матери, что указывает на то, что некоторые виды млекопитающих могут производить недостаточно молока для новорожденного. (рис. 4.1).

В настоящее время к млекопитающим отнесено более 4 тыс. видов, но состав молока изучен только у 200, причем по 60 из них рассматривалось менее 10 образцов (Jenness, 1974, 1980). Обычно наблюдаются значительные внутривидовые колебания процентного содержания белка, вероятно, из-за различий в генотипе и/или в условиях окружающей среды. Исследования показали, что содержание молочного белка в зависимости от вида может варьировать от 1 до 20%. Молоко представляет собой коллоидную гетерогенную систему, в которой минеральные соли, лактоза и некоторые сывороточные белки, растворенные в воде, образуют непрерывную (дисперсионную – п.п.) фазу, а мицеллы казеина – дисперсную фазу. Жир присутствует в этой эмульсии в виде крошечных шариков, мембраны которых состоят в основном из фосфолипидно-белкового комплекса. Биохимический состав и характеристики молока варьируют в зависимости от вида, отражая пищевые потребности новорожденного (Jenness and Sloan, 1970; Jenness, 1979; Davis and Collier, 1983; Targowski, 1983).

В течение длительного времени изучалось использование молока в питании как взрослых людей, так и детей, в том числе грудного возраста. По сравнению с молоком других видов козье считается хорошим источником белков и аминокислот (таблицы 4.1–4.4).

В последние десятилетия молоко считается важным передатчиком химической информации (Teschemacher et al., 1977; Teschemacher and Brantl, 1994; Teschemacher, 1995). Ранее довольно малое число исследователей было посвящено изучению содержания в молоке нейромедиаторов и гормонов (Blanc, 1982). В настоящее же время в сотнях работ рассматривается наличие в молоке пролактина, мелатонина, окситоцина, гормона роста, рилизинг-гормона, лютеинизирующего гормона, тиреотропного гормона, вазоактивного интестинального пептида, кальцитонина, нейротензина, холецистохинина, что указывает на то, что молоко можно считать своего рода “экзогенной эндокринной системой” новорожденного (Mackle and Bauman, 1998). Через молоко эти гормональные вещества достигают свой орган-мишень (Choick, 1998).

Знания о протеинах молока также значительно расширились. Например, было определено функциональное значение некоторых казеинов и белков молочной сыворотки, обнаружены доказательства важности биопептидов (аминокислотных последовательностей в пищевых протеинах). Эти пептиды неактивны, когда присутствуют в нативном белке, но могут высвобождаться в активной форме после протеолитического расщепления (т.е. при переваривании в ЖКТ или технологической обработке). Начиная с 1980-х гг. многие авторы описывали активные биопептиды, полученные из молочных белков, которые, в отличие от эндогенных биопептидов, обладают многими биологическими функциями (Yoshikawa et al., 1988). С тех пор пищевая значимость молока, например, в рационе спортсменов, возросла. Спортсменам необходимо потреблять белки с высокой биологической ценностью для поддержания положительного баланса азота во время физической активности, увеличения мышечной массы, восстановления после травм (рис. 4.2). В этих случаях, поскольку потребность в белке увеличивается в 2-3 по сравнению со средним уровнем, из-за высокого потребления белка могут пострадать почки. Последствиями интенсивной физической активности могут быть: дефицит питательных веществ; образование свободных радикалов, которые также могут привести к иммунологической недостаточности; недостаток железа во время аэробного стресса с последующим ограничением работоспособности. Ввод железа в рацион в некоторых случаях может иметь нежелательные последствия. Поэтому и в спортивном питании ряд автором рекомендует использование козьего молока (Domeniconi and Balzola, 1980).

Молоко имеет две основные белковые фракции: преобладающие казеины, а также белки молочной сыворотки (Law and Brown, 1994). Качественное и количественное содержание каждой белковой фракции зависит от многих факторов: физиологических (фаза лактации, число лактаций), условий окружающей среды (климат, гигиенические условия), генетических (порода, происхождение), кормления (Polidori et al., 1991). В молоке присутствуют шесть основных белков: четыре казеина (αS1, αS2, β и κ) и два сывороточных белка (α-лактоальбумин и β-лактоглобулин) (Perez and Calvo, 1995). Белковая фракция козьего молока, как и у других жвачных, состоит преимущественно из казеинов, на долю которых приходится 80% всех белков (Ambrosoli et al., 1988).

Было продемонстрировано, что уровни мРНК для четырех казеинов, продуцируемых эпителиальными клетками молочной железы во время лактации, почти одинаково распространены (~ 25% каждого), в то время как уровни зрелых белков в молоке сильно различаются (Bevilacqua et al., 2006). В частности, эффективность трансляции для αS1- и β-казеина примерно в четыре раза выше, чем для αS2- и κ-казеина, что свидетельствует о том, что регуляция биосинтеза казеина также контролируется на трансляционном уровне.

Наиболее распространенными молочными белками являются три казеина (αS1, αS2 и β), которые чувствительны к кальцию. Биосинтез казеина осуществляется на клеточном уровне под влиянием внешних факторов, таких как гормоны (рис. 4.3 и 4.4). Казеин представляет собой глобулярный белок, присутствующий в молоке в виде коллоидной суспензии, имеющей вид мицелл. Он характеризуется гидрофобным ядром и заряженной полярной гидрофильной частью. Анионные области полярной части ответственны за чувствительность к Ca2+ и некоторые физико-химические свойства этого белка (Jaubert et al., 1999). Более того, казеины относительно гидрофобны, и в ионных условиях, как в молоке, они склонны переходу в их типичную коллоидную форму (мицеллы). Мицеллы состоят из белковой фракции и минерального компонента (кальция и фосфата). Казеины представляют собой группу специфических фосфопротеинов молока, которые осаждаются при подкислении молока до pH 4,6-4,7 при 20 °C, ферментативной обработке (химозин) или ультрацентрифугированием. Казеины богаты пролином, глутаматом и глутамином и бедны глицином и аспартатом. Для сохранения казеина в молоке в стабильной форме требуется большое количество кальция и фосфата, чтобы он выступал важным источником аминокислот.

Очень важное свойство молока, особенно козьего, связано с содержанием в нем сложных олигосахаридов как в свободной форме, так и конъюгированных с белками. Было продемонстрировано благотворное противовоспалительное действие этих веществ, особенно при воспалительных заболеваниях кишечника (Daddaoua et al., 2006).

Aschaffenburg и Drewry (1955) впервые сообщили о наличии двух вариантов β-лактоглобулина в коровьем молоке. С тех пор отмечены и другие случаи полиморфизма как казеинов, так и сывороточных белков. Для генетического улучшения животных и улучшения характеристик молока ведется молекулярная и биохимическая характеристика полиморфных белков, что подробно рассмотрено в работах Ng-Kwai-Hang (1997, 1998). С этим связаны различия в составе казеинов или сывороточных белков, а также в физико-химических свойствах молока, связанных с казеификацией (Martin et al., 2002).

В последние десятилетия для идентификации генетических вариантов белков широко используются методы электрофореза (Russo et al., 1981, 1986; Martin, 1993; Martin et al., 1999). Молекулярная причина полиморфизма белка – замена или делеция аминокислот в белковой цепи (табл. 4.5). Аллели, связанные со сниженным синтезом белка, описаны многими авторами (см. обзор Valentine, 1998, молекулярные аспекты). Эти модификации приводят к изменения физико-химических свойств молока, таких как заряд, поверхностная гидрофобность, размер и форма частиц (Russo et al., 1981, 1986; Addeo et al., 1987, 1989; Grosclaude et al., 1987; Dall'Olio et al., 1988, 1989; Brignon et al., 1989; Di Gregorio et al., 1989). Такие модификации рассматриваются с помощью электрофоретических и хроматографических методов (Addeo et al., 1988). По каждой белковой фракции выявлены различные генетические варианты (Mercier and Vilotte, 1993). Эти различия в первичной структуре белка могут сильно изменить его молекулярные характеристики. Соотношения между различными белковыми фракциями могут варьировать и регулируются структурными генами (Parma et al., 1999a,b; Rando et al., 2000). Поскольку каждый из четырех типов казеина является полиморфным, можно идентифицировать различные генетические варианты. Полиморфизм можно объяснить двумя основными факторами: генетическими вариантами и посттрансляционными модификациями, обусловленными различной локализацией сайтов фосфорилирования или гликозилирования в аминокислотной последовательности первичной структуры (Bouniol et al., 1993, 1994; Ramunno et al., 1994; Klose, 1999). Внутренняя электрофоретическая гетерогенность казеиновых фракций обусловлена наличием в этих белках неполностью фосфорилированных или гликозилированных участков (Bevilacqua et al., 2002; Martin, 1993; Ramunno et al., 2004).

αS1- и αS2-казеины различаются по содержанию фосфорных групп, тогда как κ-казеин – по содержанию глюцидных и фосфорных групп (Boulanger et al., 1984; Leroux et al., 1992, 2003; Iametti et al., 1996). Неоднородность β-казеина возникает из-за неполного насыщения его сайтов фосфорилирования (Chianese et al., 1993).

Наиболее изучен полиморфизм козьего молока в отношении αS1-казеина (Bouniol et al., 1993; Remeuf, 1993; Jansa-Pérez et al., 1994; Remeuf et al., 1995; Feligini et al., 1995, 1996, 1998; Chianese et al., 1996; Pena et al., 1998; Martin et al., 1999; Iametti et al., 2000). Ген, кодирующий этот белок, является геном основного действия из-за наличия аллелей, отвечающих за значительные различия в содержании такого белка в молоке (Parson and Heflick, 1997). На хромосомном уровне семь аллелей связаны с кодификацией трех различных уровней αS1-казеина в молоке: αS1-Cn A, αS1-Cn B и αS1-Cn C, т.н. “сильные аллели”, связаны с выработкой 3,6 г/л на аллель; αS1-Cn E, т.н. “средний аллель”, связан с выработкой 1,6 г/л на аллель; αS1-Cn D и αS1-Cn F, т.н. “слабые аллели”, связаны с выработкой 0,6 г/л на аллель; αS1-Cn 0, который, по-видимому, является “нулевым аллелем”, при гомозиготной форме которого казеин не синтезируется (Brignon et al., 1990; Pierre et al., 1998a,b). Следовательно, молоко, производимое гомозиготными особями AA, EE, FF и 00, должно содержать 7,2, 3,2, 1,2 и 0 г αS1-казеина/л соответственно (таблицы 4.6 и 4.7). Некоторые примеры основных методов электрофореза, используемых при анализе белкового профиля козьего молока, представлены на рис. 4-6–4-9 (Jaubert and Martin, 1992; Cattaneo et al., 1996; Recio et al., 1997; Roncada et al., 1997, 2002a,b, 2003a,b,c, 2004; Murakami et al., 1998; Bini and Roncada, 1999; Roncada and Greppi, 1999).

По сравнению с другими генотипами молоко животных с “сильным” генотипом по локусу αS1-казеина хорошо подходит для производства молочных продуктов благодаря следующим свойствам:

Даже если количественные различия между генетическими вариантами отдельных белков невелики (Di Luccia et al., 1990; Grousclaude et al., 1994; Noè, 1995; Lamberet et al., 1996; Enne et al., 1997; Bramanti et al., al., 2003; Noè and Greppi, 2003), они могут прямо или косвенно влиять на технологические и питательные свойства молока (Ambrosoli et al., 1988; Addeo et al., 1989; Heil and Dumond, 1993; Remeuf, 1993; Pirisi et al. al., 1994; Vassal et al., 1994; Delacroix-Buchet et al., 1996; Buchin et al., 1998; Trujillo et al., 1998; Clark and Sherbon, 2000). Основные исследования полиморфизма козьего казеина представлены в таблице 4.8.

β-казеин – наиболее распространенный из казеинов в SDS-PAGE (электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли – п.п.) (рис. 4.5), дает две полосы, β1 и β2. Эти две изоформы (β1 и β2) отличаются друг от друга наличием шести и пяти фосфорных групп, соответственно (Galliano et al., 2004).

Некоторые исследования показали, что итальянские породы коз могут иметь “нулевой” аллель β (β-Cn 0), связанный с аллелем αS1-Cn A (Ramunno et al., 1996; Cosenza et al., 2003). Он снижает содержание в молоке β-казеина, но также связан с повышением содержания αS1- и общего казеина. Кроме того, по сравнению с гетерозиготными особями молоко гомозиготных β-Cn 0/0 коз имеет: втрое большее время свертывания; менее плотную консистенцию сгустков; пониженный выход сыра качотта (Chianese et al., 1993; Pena et al., 1998)

Исследований αS2-казеина не так много, как αS1-. У αS2-казеин известны три генетических варианта, A, B и C (Bouniol et al., 1994), идентифицированные с помощью электрофоретических методов, таких как изоэлектрическое фокусирование и SDS-PAGE. Аллели отличаются друг от друга только заменой одной аминокислоты, связанной с сайтом фосфорилирования. Связь между αS1-Cn и κ-Cn кажется не такой сильной, как между αS1-Cn и β-Cn (Chang et al., 1993).

У κ-казеина также обнаружен генетический полиморфизм в локусе κ-Cn (Di Luccia et al., 1990; Angiollo et al., 2002; Yahyaoui et al., 2003; Prinzenberg et al., 2005). У него два известных варианта, А и В, которые, вероятно, отличаются всего одним аминокислотным остатком. Физико-химические свойства κ-казеина характеризуются растворимостью в присутствии Ca2+ и чувствительностью к химозину. Его содержание в молоке влияет на коагуляцию, так как эта фаза начинается только тогда, когда гидролизуется весь κ-казеин.

Хотя тесной связи между αS1- и β-казеином пока не выявлено, предполагается, что между всеми казеиновыми локусами у коз существует много корреляций, как и у КРС (Parma et al., 1999a,b, 2003a, б).

Алиментарная непереносимость – это патологическая реакция организма, возникающая после приема пищи независимо от задействованного патогенетического механизма. Аллергия определяется как сумма клинических симптомов (например, ринит, удушье, экзема), которые появляются после контакта между антигеном (например, пылевыми клещами, пыльцой, коровьим молоком, свининой, ячменем) и специфическим антителом класса “эпсилон” (IgE) иммуноглобулинов. IgE обычно прикрепляются к поверхности различных типов клеток, таких как мастоциты и полиморфноядерные базофилы. Контакт между антигеном и его специфическим IgE приводит к выработке медиаторов, таких как гистамин, которые вызывают чрезмерный иммунный ответ, от чего и происходит гиперчувствительность. Свободный гистамин присутствует в значительных количествах в тунце, скумбрии, другой рыбе с темным мясом и в выдержанном сыре. Другие пищевые продукты, такие как клубника, помидоры и белок куриного яйца, вызывают высвобождение гистамина за счет определенных механизмов. Сходна реакция и на лецитины, содержащихся во фруктах, многих овощах и злаках (Carbonaro et al., 1996; Bellioni-Businco et al., 1999; Картони и др., 1999).

Если вышеупомянутые и многие другие биологически активные вещества (например, антиоксиданты, противомикробные препараты, токсины, микроорганизмы) присутствуют в больших количествах, они могут вызывать самые разнообразные симптомы, проявление которых зависит от индивидуальной чувствительности каждого человека. Люди с гиперактивными слизистыми оболочками органов ЖКТ и дыхания или с кожной восприимчивостью имеют низкий порог реакции и, таким образом, на них действует присутствие малых количеств антигена (биологически активного агента в пище), при этом проявляется симптоматика, типичная для пищевой аллергии.

Коровье молоко содержит не менее 20 различных белков, но только пять из них связаны с аллергией: сывороточный альбумин, γ-глобулин и α-лактоальбумин, которые термолабильны и поэтому легко дезактивируются, а также β-лактоглобулин и казеин, термостабильные и устойчивые к протеолитическому действию пищеварительного аппарата. У грудных детей структура любого потребленного молочного белка останется неизменной, то есть аминокислоты не будут удалены из его пептидной цепи из-за недостаточной ферментативной активности протеаз или отсутствия специфического фермента в кишечнике. Следовательно, молочный белок иммунной системой может быть признан инородным (антигеном). Количество абсорбированного антигенного материала зависит от анатомических барьеров (слизь, эпителий) и/или удаления его иммунологическими барьерами вследствие сочетания антигенов с секреторными иммуноглобулинами (IgA) на поверхности эпителия. Это важное защитное действие, снижающее проникновение аллергенов, поскольку антигены (молочные белки) не имеют доступа к IgE и IgG. Если эти барьеры ослаблены воспалительными процессами или недостатком IgA, проникновение большого количества антигенов может вызвать чувствительность и аллергию. Обычно у новорожденных редка непереносимость материнского молока, за исключением детей с серьезными нарушениями обмена веществ (фенилкетонурия, галактоземия) или заболеваниями, которые могут потребовать прекращения вскармливания (желтуха и пр.). Однако в ряде случаев детьми, находящимися на грудном вскармливании, не переносится коровье молоко, так как некоторые его термостабильные белковые компоненты (β-лактоглобулин и казеин) усваиваются практически в неизменном виде и распознаются гиперчувствительными субъектами как “чужеродные” белки. Непереносимость коровьего молока обычно определяется как аллергия к белкам коровьего молока (CMPA, или АБКМ) или непереносимость белков коровьего молока и может затрагивать 2-4% населения. В педиатрии предполагаемая частота непереносимости коровьего молока колеблется от 1 до 8%, а частота предрасположенности среди населения в целом колеблется от 15 до 20%. Аллергия на коровье молоко – самая частая пищевая аллергия в развитых странах.

АБКМ может быть иммунологического или неиммунологического происхождения. Среди неиммунологических причин наиболее известна непереносимость лактозы, вызванная недостатком лактазы в кишечнике. Однако не все симптомы, обнаруживаемые у восприимчивых людей после употребления определенных продуктов, вызваны пищевой аллергией (т.е. с доказанной или вероятной иммунологической этиологией). На самом деле во многих случаях такие нарушения связаны с пищевой непереносимостью, псевдоаллергией или идиосинкразией.

АБКМ включает различные типы аллергии:

Факт, что клиническая симптоматика АБКМ связана с белками, приводит к нехватке специфических диагностических инструментов. Например, общий и специфический IgE – диагностический показатель только при АБКМ I типа, в то время как биопсия кишечника и тест на проницаемость трудновыполнимы и подходят только для энтеропатических форм. Существуют предрасполагающие факторы, которые могут способствовать появлению симптомов АБКМ, они коррелируют с:

Как отмечалось ранее, воспалительное заболевание кишечника повышает проницаемость эпителия и, как следствие, риск реакции вследствие непереносимости или аллергии. Более чем у четверти новорожденных, перенесших гастроэнтерит в первые месяцы жизни, в последующем наблюдалась симптоматика АБКМ. Кроме того, значительного числа детей, перенесших гастроэнтерит в течение 1-3 лет жизни, в дальнейшем проявляются симптомы АБКМ.

Несмотря на важную роль коровьего молока, его можно заменить другими продуктами питания. В этом обнадеживают немногочисленные пока исследования, посвященные использованию козьего молока в питании людей (Dore et al., 1993). Кроме того, сообщается, что козье молоко является одной из лучших альтернатив для производства гипоаллергенных смесей для детей раннего возраста в случае аллергии на коровье (D’Auria et al., 2005). Новые исследования в этой области показали, что аллергия на козье и овечье молоко отличается от аллергии на коровье тем, что поражает детей более старшего возраста и проявляется позже. Продукты из коровьего молока не вызывают каких-либо клинических проявлений у пациентов с аллергией на козье и овечье молоко, тогда как козье и овечье молоко могут вызывать перекрестную реакцию у пациентов с аллергией на коровье молоко (Ah-Leung et al., 2006).